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熱啟動(dòng)PCR常用于增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。熱啟動(dòng)PCR主要借助一種酶的修飾物（如抗體、親和配體、適體或化學(xué)修飾物）來抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應(yīng)體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結(jié)合能力降低，從而避免了非特異性擴(kuò)增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動(dòng)技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，而無需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。
當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱步驟，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活（圖1）。激活時(shí)間和溫度根據(jù)DNA聚合酶及熱啟動(dòng)修飾物的不同而有所差別。對(duì)于某些聚合酶，激活和預(yù)變性合并成了一步。
圖1. 基于抗體熱啟動(dòng)技術(shù)的DNA聚合酶
降落PCR（Touchdown PCR）
另一種提升PCR反應(yīng)特異性的方法是調(diào)整PCR循環(huán)的參數(shù)。在降落PCR儀中，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設(shè)定為比引物的高退火溫度（Tm）再高幾度[1,2]。較高的溫度有助于避免產(chǎn)生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復(fù)合物，因此可以減少不希望出現(xiàn)的擴(kuò)增。就這一點(diǎn)來說，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產(chǎn)物，在PCR起始階段促進(jìn)特異性的擴(kuò)增。
雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結(jié)合，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì)加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低。為了克服這個(gè)問題，在開始的幾個(gè)循環(huán)中，退火溫度通常設(shè)置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以獲得足量的預(yù)期擴(kuò)增子。當(dāng)退火溫度降低到溫度時(shí)（通常比低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環(huán)都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì)出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物（圖2）。
圖2. 降落PCR。通過以較高的溫度起始，再隨著循環(huán)逐漸降低到退火溫度（黑色曲線），這種PCR方法可提升反應(yīng)特異性（黃色曲線）。目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量（綠色曲線）相應(yīng)的得到富集。
巢式PCR（Nested PCR）
巢式PCR是常規(guī)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在此方法中，需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：一對(duì)（外引物）在目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的側(cè)翼，而另一對(duì)引物（巢式引物）對(duì)應(yīng)于所擴(kuò)增DNA的準(zhǔn)確區(qū)域。輪PCR的產(chǎn)物之后作為第二輪PCR的模板（圖3）。圖3. 巢式PCR
如果對(duì)引物（外引物）由于引物錯(cuò)配擴(kuò)增出了非特異性產(chǎn)物，第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，所以通過第二對(duì)引物的擴(kuò)增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的另一個(gè)好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物。
快速PCR（Fast PCR）
在快速PCR中，通過縮減PCR步驟所需的時(shí)間來完成更快的擴(kuò)增，而不影響擴(kuò)增產(chǎn)量和效率?？焖傺h(huán)條件尤其適用于均有高擴(kuò)增能力的DNA聚合酶，這種聚合酶在每次結(jié)合中可引入更多的核苷酸。高擴(kuò)增能力的聚合酶可保持高擴(kuò)增效率，而PCR延伸時(shí)間是Taq聚合酶（低擴(kuò)增能力）延伸時(shí)間的1/2到1/3。通過將引物退火和延伸（如果溫度僅相差幾度）合并成一步，PCR反應(yīng)時(shí)間可進(jìn)一步縮短。這個(gè)方案也被稱為兩步PCR方案。
當(dāng)使用低擴(kuò)增能力的DNA聚合酶（如Taq酶）擴(kuò)增<500>
另一種快速PCR的調(diào)整方法為縮短變性時(shí)間，將溫度升高到98℃。使用這種策略需要注意的是，不是高度熱穩(wěn)定的聚合酶在如此高溫下容易變性。
直接PCR（Direct PCR）
直接PCR意指直接從樣本中擴(kuò)增目的DNA，而無需核酸純化。直接PCR中，在高溫變性階段，諸如細(xì)胞、組織等材料在*的緩沖液中裂解，釋放出DNA。因此這種方法簡化了PCR實(shí)驗(yàn)流程，減少了動(dòng)手操作的時(shí)間，同時(shí)可避免純化步驟中DNA的損失：常規(guī)PCR與直接PCR對(duì)比。
推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴(kuò)增。細(xì)胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì)抑制PCR反應(yīng)。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴(kuò)增微量的DNA。
高GC含量PCR（GC-rich PCR）具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強(qiáng)氫鍵影響，比較難以擴(kuò)增。高GC含量序列同時(shí)也涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴(kuò)增時(shí)卡住，從而影響了DNA的合成。
為了擴(kuò)增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結(jié)合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強(qiáng)GC相互作用，常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性，如DMSO。這些試劑通常會(huì)降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應(yīng)的調(diào)整。
高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強(qiáng)結(jié)合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴(kuò)增。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴(kuò)增，因?yàn)楦叩淖冃詼囟龋ㄈ?8℃代替95℃）可促進(jìn)解鏈和PCR擴(kuò)增。
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